Идентификация возбудителя стеблевого меланоза пшеницы Pseudomonascichorii методом ПЦР в режиме "реального времени"

Фитопатогенная бактерия Pseudomonas cichorii поражает широкий перечень сельскохозяйственных культур, в том числе вызывает стеблевой меланоз пшеницы - культуры стратегического значения для России. Возбудитель стеблевого меланоза регулируется импортерами российской зерновой продукции. В связи с этим, важная задача - актуализация метода идентификации P. cichorii на основе полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) . В качестве мишени для ПЦР-РВ использован участок длиной 90 п.о. одного из известных генов патогенности hrcRST P. cichorii. Положительный результат ПЦР-анализа был получен для референтных штаммов P. cichorii и подтвержден секвенированием ДНК последовательности ампликона. Полученные нуклеотидные последовательности были сопоставлены с гомологичными фрагментами генома типового штамма DSM 50259. В результате сравнительного анализа ДНК были изменены последовательности прямого праймера и зонда. Для зонда была показана возможность применения доступной на территории РФ модификации в которой используется сочетание красителя FAM и гасителя флуоресценции BHQ.Оценку специфичности новой праймерной системы ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 проводили с использованием 107 штаммов бактерий рода Pseudomonas , включая P. cichorii, P. fuscovaginae, P. syringae , P. trivialis , P. viridiflava , P. chlororaphis , P. lutea , P. orientalis. С ДНК 4-х штаммов ( P. poae, P. graminis и 2 штамма P. fluorescens ) показана неспецифичная реакция на 35-37 пороговом цикле, накопление не имело экспоненциальный вид. Аналитическая чувствительность теста позволяет обнаружить P. cichorii в концентрации 10¹ КОЕ/мл. Тест ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 может быть использован в качестве отборочного при обнаружении P. сichorii в растительной продукции и для характеристики чистых бактериальных культур.

The phytopathogenic bacterium, Pseudomonas cichorii , affects a wide range of crops in filed and greenhouse production and causes wheat stem melanosis, which has been regulated by importers of Russian grain products. It is crucial to update the identification method based on real-time polymerase chain reaction (PCR) (PCR-RT). This method helps confirming P. cichorii in wheat samples. A 90 base pair long section of the hrcRST pathogenicity gene cluster was used as the target. Positive results were obtained for reference strains, confirmed by amplicon sequencing. Nucleotide sequences were then compared to the typical strain, DSM 50259. As a result of comparative DNA analysis, the sequences of the direct primer and probe were modified. The possibility of using a modification of 6FAM/BHQ1 dye/quencher available on the territory of the Russian Federation was demonstrated. The specificity of the new PCR-RT primer system PscF/PscHrc751R/PscP1 was assessed using 107 bacterial strains of the genus Pseudomonas , including P. cichorii, P. fuscovaginae, P. syringae, P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P. lutea and P. orientalis . The DNA of 4 strains ( P. poae , P. graminis and 2 strains of P. fluorescens ) showed a non-specific reaction at the 35-37 cycle threshold, with an accumulation that did not appear exponential. The analytical sensitivity of the test allows for the detection of P. cichorii at a concentration of 10^1 CFU/mL. The PCR-RV PscF/PscHrc751R/PscP1 test can be used as a screening tool for the detection of P. cichorii in plant products and for the characterization of pure bacterial cultures.