Исследование белка PCP4 как потенциального опухолевого маркера лейомиомы матки

Цель: Оценка возможной роли белка PCP4 как потенциального опухолевого маркера лейомиомы матки с помощью измерения титра антител к этому белку в сыворотках крови и применимости такой методики для оценки белков как потенциальных вакцинных антигенов. Материалы и методы: Клонирован фрагмент кДНК, содержащий ген PCP4 из узла лейомиомы, сконструирован продуцент растворимого химерного белка PCP4-GFP на основе E. coli, проведена очистка рекомбинантного белка, после чего он был использован для исследования предельного титра антител в сыворотках крови больных с применением непрямого иммуноферментного анализа. Сыворотки доноров крови (24 образца) отбирали среди пациентов, проходивших лечение в НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова МЗ РФ, давших информированное согласие на участие в исследовании. Для исследования иммунологической активности сывороток в отношении белка 6His-PCP4hs-GFP было сформировано четыре группы пациентов: контрольная группа мужчин; группа женщины без диагностированных миом, у которых в анамнезе имелось пять или более успешно завершившихся беременностей, группа женщин с миомами, также с пятью или более успешно завершившимися беременностями, а также женщины с рецидивирующими миомами. Результаты: Из кДНК миоматозного узла с драйверной мутацией в гене MED12 была получена экспрессионная конструкция в векторе pRSET-EmGFP, содержащая ген PCP4 и репортерный ген зеленого флуоресцентного белка EmGFP. С помощью данной конструкции, встроенной в геном E. coli, удалось получить белок человека PCP4 в препаративных количествах, достаточных для изучения его реакции с антителами из сывороток крови различных групп пациентов. Наиболее высокую иммунологическую реактивность в отношении белка 6His-PCP4hs-GFP показали сыворотки контрольной группы мужчин, тогда как группы женщин в среднем незначительно отличались друг от друга: минимальное различие выявлено между сыворотками групп 2 и 4, причем реакция сывороток женщин с рецидивирующими миомами оказалась выше, чем сывороток женщин без миом, имевших пять или более успешно завершившихся беременностей. При сравнении женщин групп 3 и 4 обнаружены статистически значимые различия в значениях оптической плотности, полученных при разведении сывороток 1:1600, 1:3200 и 1:6400, причем реакция сывороток женщин с рецидивирующими миомами оказалась выше, чем сывороток женщин с миомами, имевших пять или более успешно завершившихся беременностей. После распределения сывороток на три категории по уровню активности было показано, что реакция сывороток мужчин на антиген 6His-PCP4hs-GFP наиболее выражена (доля высокоактивных сывороток 60%), а в группе женщины без миом, имевших пять или более успешно завершившихся беременностей, доля низкоактивных сывороток составила 44%, что является максимальным показателем по сравнению с другими группами. Для группы женщин с миомами, имевших пять или более успешно завершившихся беременностей, наиболее характерен средний уровень реактивности с антигеном 6His-PCP4hs-GFP: на долю этой категории приходится 75% сывороток, что является максимальным показателем среди всех групп. Наконец, для группы женщин с рецидивирующими миомами характерно равное количество сывороток с высокой средней активностью, что показывает большую склонность пациенток этой группы к выработке антител против PCP4/PEP19 по сравнению с многорожавшими женщинами. Заключение: Впервые был получен белок PCP4 человека в препаративных количествах, достаточных для изучения его реакции с антителами из сывороток различных групп пациентов. Тестирование показало, что большая часть образцов во всех группах имеет значимые титры антител к PCP4. Активность этих антител варьирует в широких пределах в сыворотках как мужчин, так и женщин. Антитела против PCP4 встречаются чаще у женщин с рецидивирующими миомами, чем у много рожавших женщин, особенно без лейомиом. Таким образом, иммунизация PCP4 вряд ли сопряжена с риском возникновения каких-либо патологий. Титры антител к PCP4 у общей группы много рожавших женщин значимо ниже, чем у мужчин и пациенток с рецидивирующими миомами. Таким образом, использование белка PCP4 в качестве основы для создания профилактической вакцины для защиты от лейомиом нецелесообразно.

Objective: Evaluation of the possible role of Purkinje cell protein 4 (PCP4) as a potential tumor marker of uterine leiomyoma by measurement of antibody titer against this protein in blood serum and the applicability of this technique for evaluation of proteins as potential vaccine antigens. Materials and methods: cDNA fragment clone was derived from PCP4 gene in leiomyoma nodule. After that the soluble PCP4- GFP chimera based on E. coli was constructed, and the recombinant protein was purified. This product was used to evaluate the upper limit of titer to detect antibodies in blood serum in patients using indirect enzyme immunoassay. Serum samples (24) were collected from donors among the patients undergoing treatment at the Academician V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, who gave informed consent to participate in the study. Four groups of patients were formed to study the immunological activity of sera against the 6His-PCP4hs-GFP protein. Group 1 was the control group and was composed of men. Group 2 consisted of women without diagnosed fibroids who had five or more successful pregnancies in history. Group 3 included women with f ibroids, who also had five or more successful pregnancies in history. Group 4 included women with recurrent myomas. Results: The pRSET-EmGFP expression vector containing the PCP4 gene and the reporter gene of the green fluorescent protein EmGFP was derived from the cDNA of the myoma nodule with a driver mutation in the MED12 gene. Human PCP4 in preparative amounts was obtained using this construct embedded in the E. coli genome, that was sufficient for analysis of its reaction with antibodies from blood serum in different groups of patients. Blood sera in the control group of men showed high immunological reactivity against the 6His-PCP4hs-GFP protein, whereas the difference between the groups of women was insignificant. Minimum difference between sera was found in groups 2 and 4. Moreover, the reaction of sera in women with recurrent fibroids was higher compared with women without fibroids, who had five or more successful pregnancies. Comparison of women in groups 3 and 4 showed statistically significant differences in the optical density values obtained in dilution of sera 1:1600, 1:3200 and 1:6400. At the same time the reaction of sera of women with recurrent fibroids was higher compared with sera of women with fibroids, who had five or more successful pregnancies. Based on the level of activity, sera were divided into 3 categories. It was found that reaction of sera of men against the 6His-PCP4hs-GFP antigen was most pronounced. The proportion of high activity in sera was 60%. In the group of women without fibroids, who had five or more successful pregnancies, the proportion of low activity in sera was 44%, that is the maximum value of indicator compared with the other groups. The group of women with fibroids, who had five or more successful pregnancies, is characterized by the moderate level of reactivity with the 6His-PCP4hs- GFP antigen. This category accounts for 75% of sera, that is the highest value of indicator among all groups. Finally, the group of women with recurrent fibroids is characterized by equal number of sera with high and moderate activity, that shows a greater tendency for production of antibodies against PCP4/PEPI9 in this group of patients compared with multiparous women. Conclusion: For the first time, human PCP4 was in preparative amounts sufficient for analysis of its reaction with antibodies from blood serum in different groups of patients. Testing showed that most samples in ail groups had significant titers of antibodies against PCP4. The activity of these antibodies varies widely both in sera of men and women. Antibodies against PCP4 are most common in women with recurrent fibroids compared with multiparous women, especially without leiomyomas. Thus, it is unlikely that PCP4 immunization carries the risk of any pathology. The titers of antibodies to PCP4 in the general group of multiparous women were significantly lower compared with men and patients with recurrent fibroids. Therefore, using PCP4 as the basis to develop a preventive vaccine against leiomyomas is not advisable.