Генетическая модификация первичных В-клеток человека для моделирования процессов в зародышевых центрах

Основные этапы созревания антиген-специфических В-клеток протекают в герминативных центрах лимфоузлов. Здесь наивные В-клетки проходят процесс соматического гипермутагенеза, а также переключение классов синтезируемых антител. В процессе дифференцировки принимается решение, по какому пути В-клетки будут развиваться далее. Они либо превратятся в короткоживущие плазмабласты, либо в В-клетки памяти или плазматические клетки. Взаимоотношение этих процессов очень важно для развития продуктивного гуморального иммунного ответа. Имеется насущная необходимость в более детальном изучении отмеченных процессов. Целью работы являлось создание системы, которая ex vivo способна моделировать процессы, протекающие в герминативных центрах. В качестве исходного материала мы использовали первичные В-клетки из периферической крови человека. После иммуномагнитной сепарации В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью фидерных клеток, несущих молекулы CD40L. Другим стимулирующим фактором являлся рекомбинантный растворимый IL-21. При IL-21/CD40L стимуляции В-лимфоциты изменяли свою морфологию, поверхностный фенотип, а также функциональную активность. После активной экспансии в течении 10 дней дальнейший рост клеток останавливался, и через некоторое время они погибали. Для получения стабильно пролиферирующих В-клеток мы использовали лентивирусную трансдукцию IL-21/CD40L стимулированных IgM+ В-лимфоцитов. Для этого были получены препараты лентивируса, которые несли кассету, состоявшую из генов BCL6 и BCL2L1, разделенных последовательностью кодирующей саморазрезаемый пептид P2A, а также репортерный ген GFP, отделенный от целевых генов элементом IRES. Использованная кассета обеспечивала в клетках-мишенях синтез транскрипционного фактора Bcl-6 и белка Bcl-XL. Репрессор Bcl-6 не позволял В-клеткам уходить в терминальную дифференцировку и превращаться в плазматические клетки, а белок Bcl-XL оказывал анти-апоптотическое действие. Трансдуцированные В-клетки пролиферировали более месяца и сохраняли фенотип плазмабластов. При этом через 42 дня после начала стимуляции трансдуцированные В-клетки оставались GFP-позитивными, коэкспрессировали антигены CD27 и CD38, несли поверхностный CD20 и IgM, внутриклеточный Bcl-6, Bcl-XL и IgM, сохраняли секрецию IgM, но оставались негативными по поверхностному и внутриклеточному IgG. Таким образом, длительное культивирование В-клеток не приводило к переключение класса синтезируемого Ig. Отработанная система стимуляции позволит имитировать ключевые аспекты развития В-клеток в зародышевых центрах для изучения формирования В-клеточной памяти, что в конечном счете будет способствовать разработке эффективных вакцин.

The main stages of maturation of antigen-specific B cells occur in the germinal centers of the lymph nodes. During the process of differentiation, a decision is made on which path the B cells will take to develop further. They will either turn into short-lived plasmablasts or memory B cells or plasma cells. The relationship between these processes is very important for the development of a productive humoral immune response. The goal of the work was to create a system that is capable of simulating ex vivo processes occurring in germinal centers. We used primary B cells from human peripheral blood as starting material. B lymphocytes were stimulated in vitro using feeder cells carrying CD40L molecules and recombinant IL-21. Upon IL-21/CD40L stimulation, B lymphocytes changed their morphology, surface phenotype, and functional activity. After active expansion for 10 days, further cell growth stopped, and after some time they died. To generate stably proliferating B cells, we used lentiviral transduction of IL-21/CD40L stimulated IgM+ B cells. For this purpose, lentivirus preparations were obtained that carried a cassette consisting of the BCL6 and BCL2L1 genes, separated by a sequence encoding the self-cutting peptide P2A, as well as a GFP reporter gene separated from the target genes by an IRES element. The cassette used ensured the synthesis of the Bcl-6 transcription factor and the Bcl-XL protein in target cells. The Bcl-6 repressor prevented B cells from undergoing terminal differentiation and becoming plasma cells, and the Bcl-XL protein had an anti-apoptotic effect. Transduced B cells proliferated for more than a month and maintained a plasmablast phenotype. Forty-two days after the start of stimulation, transduced B cells remained GFP-positive, coexpressed CD27 and CD38 antigens, carried surface CD20 and IgM, intracellular Bcl-6, Bcl-XL and IgM, retained IgM secretion, but remained negative for surface and intracellular IgG. The proven stimulation system will allow us to simulate key aspects of B cell development in germinal centers to study the formation of B cell memory, which will ultimately facilitate the development of effective vaccines.