Иммунный ответ, формируемый введением трансгенным мышам ДНК-вектора, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человека

Во всем мире растет число больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Важнейшим моментом в диагностике диффузного токсического зоба является выявление аутоантител к рецептору тиреотропного гормона (рТТГ) в сыворотке крови больных. Для дифференциальной диагностики антител к антигенам щитовидной железы перспективно тестирование на основе моноклональных антител к рецептору тиреотропного гормона человека, которые можно получить не только в результате иммунизации животных нативным или рекомбинантным белком рецептора тиреотропного гормона, но и при ДНК-иммунизации генно-инженерными конструкциями, содержащими фрагменты гена рТТГ. На базе мРНК, выделенной нами из ткани щитовидной железы пациентов с диффузным токсическим зобом, клонирован ряд фрагментов гена рецептора тиреотропина, которые могли бы быть пригодны для ДНК-иммунизации животных; оценить один из сконструированных векторов - pVAX1рТТГ (1160) в качестве иммуногена на мышиной модели стало целью настоящей работы. Наличие фрагмента гена рецептора тиреотропного гормона, размером 1160 п.н., который был трансфецирован в составе вектора pVAX1 в клеточную линию СНО, было установлено методами иммуноблоттинга и ИФА. Иммунный ответ, формирующийся на введение мышам линии BALB/с вектора pVAX1, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человека, был выявлен в разных вариантах ИФА. Иммунизация животных ДНК-вектором pVAX1-рTТГ по экспериментально подобранной схеме оказалась эффективной для формирования у опытных животных спленоцитов, секретирующих антитела к рецептору тиреотропного гормона человека, которые были использованы для успешной гибридизации. Это подтверждалось результатами определения антитело - продукции к рецептору тиреотропного гормона человека в сыворотках крови мышей: уровень продукции антител оставался высоким (титр более 1:10 000) на 8-й неделе эксперимента. В результате селекции индивидуальных клонов по критериям пролиферативной активности и стабильности продукции антител были отобраны наиболее стабильные культуры гибридом, секретирующие МкАт против рецептора тиреотропного гормона человека.

The number of patients with autoimmune thyroid diseases (Graves'disease, Hashimoto'sthyroiditis) is increasing globally. The most important part in the diagnosis of Graves' disease (GD) is the detection of autoantibodies to the thyrotropin receptor (TSHR) in Graves' patients' sera. For the differential diagnosis of antibodies to thyroid antigens, it is promising to use tests based on monoclonal antibodies to TSHR, which can be obtained not only as a result of immunization with native or recombinant TSHR protein, but also through DNA immunization with genetically engineered constructs containing fragments of the TSHR gene. Based on mRNA we isolated from the thyroid tissue in GD, a number of fragments of the thyrotropin receptor gene were cloned, suitable for DNA immunization of animals. The purpose of this work is to evaluate the immunogenic properties of one of the constructed vectors, pVAX1-TSHR (1160), in a mouse model. The successful inclusion of the extracellular domain gene fragment of the human TSHR (1160), which was transfected into CHO cells as a part of the pVAX1 vector was confirmed by immunoblotting and ELISA. The immune response formed to the injection of the pVAX1 vector into BALB/c mice, containing a fragment of the human TSHR gene, was detected in different versions of ELISA. Immunization of animals with the DNA vector pVAX1-TSHR according to an experimentally selected scheme was effective for the formation of mouse splenocytes, secreting antibodies to TSHR, which were used for successful hybridization. This was confirmed by the results of determining antibody production to TSHR in murine blood sera. The level of antibody production remained high (titer more than 1:10.000) at the 8th week of the experiment. As a result of selection of individual clones according to the criteria of proliferative activity and stability of antibody production, the most stable cultures secreting mAbs against TSHR were selected.