Секвенирование генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов при острой SARS-CoV-2-инфекции

Введение. Несмотря на бурное развитие высокопроизводительного секвенирования, для генов Ig до сих пор основным методом остается секвенирование из единичных В-лимфоцитов по Сэнгеру. С помощью этого метода был получен целый ряд моноклональных антител (МкАт) для лечения и профилактики COVID-19. В качестве источника генов Ig обычно выступают В-клетки памяти или плазматические клетки. Еще одним привлекательным объектом для секвенирования генов Ig и последующего создания антиген-специфических МкАт являются циркулирующие плазмабласты, которые совмещают в себе такие свойства, как высокий уровень экспрессии мРНК и экспрессия поверхностного В-клеточного рецептора. Цель исследования - оптимизация метода секвенирования генов Ig из единичных циркулирующих плазмабластов. Исследование выполнено на примере плазмабластов, формирующихся при острой SARS-CoV-2 инфекции. Материал и методы. Забор крови у пациента с тяжелой формой COVID-19 проводили на 10-й день от появления первых симптомов. Плазмабласты выделяли из мононуклеарной фракции клеток крови с помощью проточного сортировщика клеток по фенотипу CD19+CD27++CD38++CD3CD16CD14^-. Секрецию IgG определяли методом иммуноферментного анализа, а антитело-секретирующие клетки - методом ELISpot. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) клетки распределяли по одной на пробирку. После лизиса клеток синтез кДНК проводили с помощью набора Invitrogen SuperScript III (США). Далее образец делили пополам и раздельно проводили полугнездовую ПЦР для амплификации вариабельных генов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру. Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием онлайн-инструмента Igblast с системой определения доменов IMGT, a также программы UGENE (версия 50.0). ПЦР-продукты, полученные из одного образца, клонировали в экспрессионные векторы AbVec-hIgG1-799 и AbVec-hIgKappa-798 для последующей наработки IgG. Клетки HEK293 котрансфецировали плазмидами, кодирующими легкую и тяжелую цепь Ig. Результаты. В предварительных экспериментах было обнаружено, что при выделении В-клеток с помощью стандартного набора для иммуномагнитной сепарации происходит потеря популяции плазмабластов. В последующем плазмабласты выделяли методом сортировки с помощью проточного цитометра. Доля плазмабластов от всех В-лимфоцитов для обследованного пациента составила 15 %. Антитело-секретирующие клетки в популяции плазмабластов составляли 38 %. Были получены 15 парных последовательностей VL- и VH-генов. Было выявлено 14 уникальных нуклеотидных последовательностей VL-генов и 10 уникальных нуклеотидных последовательностей VH-генов. Полученные последовательности отличались от зародышевой конфигурации VH и VL в пределах от 0 и до 25 % (медиана 9 %) и от 0 до 11 % (медиана 7 %) соответственно. CDR3-участки VH генов заметно отличались друг от друга, в то время как CDR3-участки VL генов были схожи между собой. На основании определенных нуклеотидных последовательностей были получены два моноклона IgG, которые секретировались в супер-натант клеток HEK293, котрансфецированных экспрессионными векторами, несущими гены тяжелых и легких цепей IgG. Заключение. Метод секвенирования генов Ig из единичных циркулирующих плазма-бластов представляет собой перспективный подход для создания человеческих МкАт. Данный метод в сочетании с предварительной стимуляцией В-лимфоцитов in vitro, сортировкой антиген-специфичных клеток, а также использование иммунодефицитных мышей открывает новые возможности для разработки таргетных препаратов. Эти походы позволяют значительно ускорить процесс разработки новых терапевтических антител, что особенно важно в борьбе с новыми инфекционными заболеваниями.

Introduction. Despite the rapid development of high-throughput sequencing for Ig genes, the main method is still Sanger sequencing from single B lymphocytes. Using this method, a number of monoclonal antibodies have been generated for the treatment and prevention of COVID-19. Memory B cells or plasma cells usually act as a source of Ig genes. Another attractive object for sequencing Ig genes and the subsequent generation of antigen-specific monoclonal antibodies are circulating plasmablasts, which combine such properties as high mRNA expression and expression of the surface B cell receptor. The aim of the study is to optimize the method for sequencing Ig genes from single circulating plasmablasts. The study was carried out using the example of plasmablasts formed during acute SARS-CoV-2 infection. Material and methods. Blood was collected from a patient with a severe form of COVID-19 on day 10 from the onset of the first symptoms. Plasmablasts were isolated from the mononuclear fraction of blood cells using a flow cell sorter by the CD19+CD27++CD38++CD3CD16CD14^-phenotype. IgG secretion was determined by enzyme-linked immunosorbent assay, and antibody-secreting cells were determined by ELISpot. For PCR, the cells were distributed one cell per tube. After cell lysis, cDNA synthesis was performed using the Invitrogen SuperScript III kit. The sample was then divided in half and semi-nested PCR was performed separately to amplify the variable genes of the heavy (VH) and light (VL) chains. The resulting PCR products were sequenced according to Sanger. Nucleotide sequences were analyzed using the Igblast online tool with the IMGT domain definition system and UGENE (version 50.0). PCR products obtained from one sample were cloned into the expression vectors AbVec-hIgG1-799 and AbVec-hIgKappa-798 for subsequent IgG production. HEK293 cells were co-transfected with plasmids encoding the Ig light and heavy chains. Results. In preliminary experiments, it was found that the isolation of B cells using a standard immunomagnetic separation kit resulted in a loss of the plasmablast population. Plasmablasts were then isolated by flow cytometric sorting. The percentage of plasmablasts in total B lymphocytes for the patient studied was 15 %. Antibody-secreting cells accounted for 38 % of the plasmablast population. Fifteen paired sequences of the VL and VH genes were obtained. 14 unique nucleotide sequences of the VL genes and 10 unique nucleotide sequences of the VH genes were identified. The obtained sequences differed from the germline configuration of VH and VL within 0 to 25 % (median 9 %) and from 0 to 11 % (median 7 %), respectively. The CDR3 regions of the VH genes differed significantly from each other, while the CDR3 regions of the VL genes were quite similar. Based on the determined nucleotide sequences, two IgG monoclones were obtained, which was secreted into the supernatant of HEK293 cells cotransfected with expression vectors carrying the genes of IgG heavy and light chains. Conclusion. The method of sequencing Ig genes from single circulating plasmablasts represents a promising approach for the creation of human monoclonal antibodies. This method, in combination with preliminary stimulation of B lymphocytes in vitro, sorting of antigen-specific cells, and the use of immunodeficient mice, opens up new possibilities for the development of targeted drugs. These approaches allow us to significantly accelerate the process of developing new therapeutic antibodies, which is especially important in the fight against emerging infectious diseases.