Оценка эффективности воздействия «усиленных» естественных киллеров, нокаутных по генам CISH и B2M, на жизнеспособность и метаболический статус клеток 3D-сфероидов глиобластомы пациентов

Одним из альтернативных подходов к лечению глиобластомы выступает клеточная иммунотерапия на основе естественных, или натуральных, киллеров (NK-клеток). Для усиления их цитотоксического эффекта на опухолевые клетки с помощью генно-инженерных технологий создаются новые NK-клеточные линии. Цель исследования - оценить эффективность влияния «усиленных» NK-клеток на ранние метаболические перестройки и жизнеспособность клеток глиобластомы пациента на модели опухолевых сфероидов. Материалы и методы. В исследовании использованы первичная культура глиобластомы человека GBM7-Luc2-mKate2, библиотечная линия NK-клеток человека YT дикого типа (YTwt), а также созданные нами линии со сверхэкспрессией белка VAV1 и нокаутированные либо по гену CISH (YT-Vav1+CISH-/-), либо по гену B2M (YT-Vav1+B2M-/-). Опухолевые сфероиды формировали в круглодонных низкоадгезивных планшетах. Иммунные клетки добавляли к сфероидам в количестве 100 тыс. клеток на 1 сфероид, и на нескольких временны´х точках оценивали жизнеспособность сфероидов путем флуоресцентного окрашивания с использованием набора живые/мертвые клетки, а также проводили визуализацию автофлуоресценции метаболического кофермента никотинамидадениндинуклеотида (фосфата) - НАД(Ф)Н - в сфероидах с использованием лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) с приставкой FLIM (Becker & Hickl GmbH, Германия). Результаты. Установлено, что параметры затухания автофлуоресценции кофермента НАД(Ф)Н в клетках глиобластомы человека существенно изменяются при воздействии как YT-Vav1+CISH-/-, так и YT-Vav1+B2M-/-, что указывает на возникновение раннего метаболического сдвига в опухолевых клетках в сторону менее агрессивного окислительного фенотипа, и это согласуется с увеличением фракции погибших и снижением фракции живых клеток в составе сфероида. Заключение. Полученные данные об усиленной цитотоксической активности новых модифицированных NK-клеточных линий в отношении сфероидов глиобластомы человека имеют важное значение для понимания механизмов взаимодействия опухолевых и иммунных клеток и развития адоптивной клеточной терапии глиобластомы.

One of the alternative approaches to glioblastoma treatment is cellular immunotherapy based on natural killer cells (NK cells). To enhance their cytotoxic effect on tumor cells, new NK cell lines are being created using genetic engineering techniques. The aim of the study was to evaluate the impact efficacy of “enhanced” NK cells on early metabolic rearrangements and the viability of glioblastoma cells in a patient using a tumor spheroid model. Materials and Methods. The study used a primary culture of GBM7-Luc2-mKate2 human glioblastoma, a line of YT (YTwt) wild-type human NK cells, as well as lines created by us with overexpression of VAV1 protein with either CISH (YT-Vav1+CISH-/-) or B2M (YT-Vav1+B2M-/-) knockouts. Tumor spheroids were produced in round-bottomed, low-adhesive plates. 100 thousand immune cells were added to each spheroid, and spheroids viability was evaluated at several time points applying fluorescence staining using a live/dead cell viability assay kit; autofluorescence of metabolic coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate), or NAD(P)H, was visualized in spheroids using an LSM 880 laser scanning microscope (Carl Zeiss, Germany) with a FLIM module (Becker & Hickl GmbH, Germany). Results. It was found that autofluorescence attenuation parameters of NAD(P)H coenzyme in human glioblastoma cells change significantly when exposed to both YT-Vav1+CISH-/- and YT-Vav1+B2M-/-, indicating occurrence of an early metabolic shift in tumor cells towards a less aggressive oxidative phenotype, and this is consistent with dead cells fraction increase and living cells fraction decrease in spheroid composition. Conclusion. The data obtained on enhanced cytotoxic activity of new modified NK cell lines against human glioblastoma spheroids are important to understand interaction mechanisms between tumor and immune cells and the development of glioblastoma adoptive cell therapy.