Исследование аэробного биосинтеза 4-гидроксимас-ляной кислоты клетками Escherichia coli при гетерологичной экспрессии гена 2-кетоглутарат -декарбоксилазы

Ген Rv1248c (kgd) Mycobacterium tuberculosis был экспрессирован в рекомбинантном штамме E. coli с инактивированными путями смешаннокислотного брожения и анаэробной генерации ацетил-КоА, а также с модифицированной системой транспорта и фосфорилирования глюкозы и измененной регуляцией гена ydfG, кодирующего NADPH-зависимую дегидрогеназу гидроксикарбоновых кислот. Установлено, что при интенсивном формировании 2-кетоглутарата в ходе аэробной утилизации глюкозы синтез 4-гидроксимасляной кислоты рекомбинантным штаммом E. coli возможен не только при прямой конверсии 2-кетоглутарата в сукцинат-полуальдегид под действием чужеродной ферментативной активности, но и в результате вовлечения соответствующего интермедиата цикла трикарбоновых кислот в каскад нативных биохимических реакций. Индуцированная экспрессия гена 2-кетоглутарат-декарбоксилазы в клетках рекомбинантного штамма обеспечивала эффективную конверсию 2-кетоглутарата в производные сукцинат-полуальдегида; при этом концентрация синтезированной 4-гидроксимасляной кислоты достигала 0,3 мМ и лимитировалась, по-видимому, активностью фермента, катализирующего терминальную стадию восстановления предшественника.

Study on Aerobic Biosynthesis of 4-Hydroxybutyric Acid by Escherichia coli Cells with Heterological Expression of 2-Ketoglutarate Decarboxylase Gene

The Mycobacterium tuberculosis Rv1248c(kgd) gene has been expressed in the recombinant Escherichia coli strain with the inactivated pathways of mixed-acid fermentation and aerobic generation of acetyl-CoA, and also with modified systems of glucose transport and phosphorylation, and gene ydfC regulation (the latter encoding the NADPH- dependant dehydrogenase of hydrocarboxylic acids). It was established that on the background of the intense formation of 2-ketoglutarate during the glucose aerobic utilization, the direct conversion of 2-ketoglutarate to succinate semialdehyde under the action of an exogenous enzymatic activity is not the only pathway for the synthesis of 4-hydroxybutyric acid by the recombinant E. coli strain. This process can also proceed via the involvement of the appropriate intermediate of the TCA cycle in a cascade of native biochemical reactions. The induced 2-ketoglutarate-decarboxylase gene expression in the recombinant strain provided the efficient conversion of 2-ketoglutarate to succinate semialdehyde derivatives which ensured the yield of the synthesized 4-hydroxybutyric acid up to 0.3 mM and seemed to be limited by the activity of the enzyme responsible for the terminal stage of the precursor reduction.