Линия сенсорных клеток для определения активности препаратов растворимого CD40L

Введение. Молекула CD40L в высокой плотности экспрессируется на активированных CD4+-Т-лимфоцитах, антиген-презентирующих, а также на некоторых других гемопоэтических клетках. Белок CD40L способен «слущиваться» с поверхности клеток-продуцентов, переходя в растворимую форму (sCD40L). Растворимый CD40L является маркером некоторых иммунопатологий, а также он может быть прогностическим маркером при некоторых формах рака. Кроме того, препараты растворимого CD40L могут оказывать супрессивное воздействие на опухолевые клетки. Таким образом, sCD40L может являться как биомаркером некоторых патологических состояний, так и терапевтическим агентом. Физиологическая активность sCD40L проявляется в связывании с рецептором CD40 и последующем запуске NF-кВ-опосредованного ответа. Создание сенсорных клеток, которые могут быть использованы для измерения физиологической активности sCD40L, имеет первостепенное значение и для научных исследований, и для клинического применения. Цель исследования - получить сенсорные линии клеток, пригодные для измерения активности растворимых белков, несущих рецепторный домен молекулы CD40L человека. Материал и методы. Стабильную трансфекцию клеток HEK293T осуществляли с помощью лентивирусного вектора. Селекцию стабильных трансфектантов выполняли с помощью проточного сортировщика клеток. В качестве лигандов для рецептора CD40 были использованы 2 рекомбинантных химерных белка, полученных путем слияния рецепторного домена CD40L с мультимеризующими доменами. В одном случае для мультимеризации был использован коллагеноподобный фрагмент адипонектина (белок LA), в другом случае - Fc-фрагмент молекулы IgG вместе с тримеризующим изолейциновым зиппером (белок LIF). Люциферазную активность определяли после лизиса клеток в лизирующем буфере GLO и добавления реагента для люциферазы (Promega, США). Хемилюминесценцию регистрировали с помощью многофункционального ридера GloMax®-Multi Jr Single-Tube (Promega, США). Результаты. Получены клетки HEK293T, экспрессирующие поверхностный рецептор CD40, а также несущие кассету из гена люциферазы, слитого с пятью копиями сайта посадки транскрипционного фактора NF-кВ. Антиген CD40 обнаруживался более чем на 98 % трансдуцированных клеток. Стимуляция сенсорных клеток препаратами LIF и LA вызывала дозозависимую активацию люциферазы. При стимуляции препаратом LIF были получены сигмоидальные кривые дозовой зависимости, которые при концентрациях выше 1 мкг/мл выходили на плато. Значения эффективной концентрации (EC₅₀), которая соответствует концентрации агониста, обеспечивающей полумаксимальный ответ, находились в области от 604 до 322 нг/мл. Если принимать, что белок LIF находится в гексамерной форме с молекулярной массой 284 кДа, то значения EC₅₀ находятся в области от 1,1 до 2,1 нМ, что свидетельствует о высокой чувствительности полученных сенсорных линий. При концентрациях выше 10 мкг/мл препараты LA обеспечивали более высокий уровень активации люциферазы, чем препараты LIF. Заключение. Получены сенсорные линии клеток с люциферазным репортером, которые в ответ на обработку рекомбинантными белками, несущими рецепторный домен CD40L, демонстрируют активацию NF-кВ-опосредованного сигнального пути. Полученные сенсорные клетки позволяют определять активность sCD40L в наномолярных концентрациях.

Introduction. CD40L molecules are expressed in high density on activated CD4+ T lymphocytes, antigen-presenting cells, and some other hematopoietic cells. The CD40L protein can be shed from the surface of producer cells and converted into a soluble form (sCD40L). Soluble CD40L is a marker of some immunopathologies and may also be a prognostic sign for some forms of cancer. In addition, soluble CD40L preparations can exert a suppressive effect on tumor cells. Thus, sCD40L can be both a biomarker of some pathological conditions and a therapeutic agent. The physiological activity of sCD40L is manifested by binding to the CD40 receptor and subsequent triggering of the NF-кВ mediated response. The development of sensor cells that can be used to measure the physiological activity of sCD40L is of paramount importance for both research and clinical applications. The aim of the study was to obtain sensor cell lines suitable for measuring the activity of soluble proteins bearing the receptor domain of the human CD40L molecule. Material and methods. Stable transfection of HEK293T cells was performed using lentiviral vector. Positive stable transfectants were separated using a flow cell sorter. Two recombinant chimeric proteins were used as ligands for the CD40 receptor. These proteins were obtained by fusing the receptor domain of CD40L with multimerization domains. In one case, a collagen-like fragment of adiponectin (LA protein) was used for multimerization, in the other case, the Fc fragment of the IgG molecule together with a trimerizing isoleucine zipper (LIF protein). Luciferase activity was determined after cell lysis in GLO lysis buffer and addition of luciferase reagent (Promega, USA). Chemiluminescence was recorded using a GloMax®-Multi Jr Single-Tube multifunctional reader (Promega, USA). Results. HEK293T cells expressing the CD40 surface receptor and carrying a cassette of the luciferase gene fused with five copies of the NF-кВ transcription factor binding site were obtained. The CD40 antigen was detected in high density on more than 98 % of transduced cells. Stimulation of sensor cells with LIF and LA caused dose-dependent activation of luciferase. When stimulated with LIF, sigmoidal dose-dependence curves were obtained, which reached a plateau at concentrations above 1 qg/ml. The effective concentration (EC₅₀) values, which correspond to the agonist concentration providing a half-maximal response, were in the range from 604 to 322 ng/ml. If we assume that the LIF protein is in the hexameric form with a molecular weight of 284 kDa, the EC₅₀ values are in the range from 1.1 to 2.1 nM, which indicates high sensitivity of the obtained sensor lines. At concentrations above 10 pg/ml, LA preparations provided a higher level of luciferase activation than LIF preparations. Conclusion. Sensor cell lines with a luciferase reporter have been obtained that demonstrate activation of the NF-kB mediated signaling pathway in response to treatment with recombinant proteins bearing the CD40L receptor domain. The obtained sensor cells allow the determination of sCD40L activity at nanomolar concentrations.